固相載體的選擇和試劑的制備
ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶的反應(yīng)底物。
1.固相載體的選擇
ELISA可用許多不同類型的固相如纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠和含F(xiàn)e2O3的磁性聚苯乙烯等材料，這些材料一共價(jià)鍵與抗原或抗體結(jié)合，但有其缺點(diǎn)，除含鐵的顆粒外，其他材料ELISA沖洗步驟中都要離心。如果固相用微量板或微量管，大顆粒或透明小燒杯就不需要離心，這些固相都是用聚苯乙烯、聚乙烯和尼龍材料制成的。固相可以預(yù)先用r射線或紫外光處理也可以不處理。幾乎所有的塑料都有吸附蛋白質(zhì)的能力，一般認(rèn)為聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。另外聚苯乙烯在ELISA測(cè)定過程中作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，加之他的價(jià)格低廉，可制成各種形狀，故被普遍采用。聚乙烯的吸附能力雖好，但因材料本身質(zhì)軟使操作不便，聚丙烯的吸附性能差，故聚乙烯和聚丙烯的使用都很少。聚苯乙烯經(jīng)過射線照射后對(duì)蛋白質(zhì)，特別是免疫球蛋白吸附性能增加，應(yīng)用于ELISA雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測(cè)抗體時(shí)空白值較大。
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)勢(shì)可將陽性和陰性參考血清分別稀釋后在不同的固相載體上按選擇的ELISA操作步驟進(jìn)行，顯色后比較每孔溶液的吸光值。在哪種載體上的陽性和陰性參考血清的反應(yīng)差別zui大，表明哪種固相zui為合適。
ELISA載體的形狀只要有三種：小試管、小珠和微量酶標(biāo)板。小試管的特點(diǎn)是可用作反應(yīng)的容器，zui后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面磨砂后吸附面積大大增加，如用特殊的洗滌器，在洗滌的過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量酶標(biāo)板，于ELISA的產(chǎn)品稱為ELISA板。上標(biāo)準(zhǔn)的微量酶標(biāo)板是96孔微量板。
ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在酶標(biāo)儀上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量酶標(biāo)板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、孵育、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
由于酶標(biāo)板在各個(gè)方面存在一些差異，因此選擇的酶標(biāo)板不僅需要于ELISA的酶標(biāo)板，而且還要考慮板的吸附能力和各孔的均質(zhì)性。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于材料的不同和制作工藝的差別，各種商品酶標(biāo)板質(zhì)量差異很大。
