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介紹免疫沉淀CHIP的實驗步驟
更新時間：2020-12-28 點擊次數(shù)：3558次
免疫沉淀CHIP的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應(yīng)設(shè)計相應(yīng)的對照，而且對結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。對于剛剛開始使用ChIP技術(shù)的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會達(dá)到事半功倍的效果。
一、細(xì)胞固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是*可逆的，便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。
二、染色質(zhì)斷裂
交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標(biāo)蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。
